『PCR實(shí)驗(yàn)污染』的解決辦法！

　　PCR污染是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都多多少少會(huì)遇到的問(wèn)題。原因在于，PCR是非常靈敏的一項(xiàng)檢測(cè)，100個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增，從而容易出現(xiàn)DNA污染導(dǎo)致的假陽(yáng)性。那么，怎樣遠(yuǎn)離PCR的污染呢？

　　圖　PCR污染之一瞥

　　首先，要辨別PCR污染的來(lái)源。設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照，有利于檢測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。尤其是設(shè)立空白對(duì)照，即包括PCR的全部組分，而不加模板DNA，這對(duì)檢測(cè)試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。

　　在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染的zui主要原因是DNA溶液的濺出和DNA氣溶膠造成的實(shí)驗(yàn)區(qū)域的污染，這尤其在PCR產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)容易出現(xiàn)。移液器槍頭和EP管架是也較常見(jiàn)的污染部位。

　　如果是環(huán)境污染，還可對(duì)每個(gè)區(qū)域進(jìn)行涂抹采樣和核酸提取，以zui終鑒定污染的區(qū)域所在。德國(guó)Minerva Biolabs公司專門生產(chǎn)有DNA污染監(jiān)測(cè)試劑盒（貨號(hào)181-0010和182-0010），比較方便使用。

　　對(duì)PCR的環(huán)境污染，有如下幾種治理方法：

　　1. 用常規(guī)消毒液定期在環(huán)境中噴霧消毒處理。

　　2. 稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；其缺點(diǎn)是鹽酸對(duì)皮膚有一定的腐蝕性。

　　3. 紫外照射法：紫外波長(zhǎng)一般選擇254/300nm，照射30分鐘至2小時(shí)。但需要注意的是，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。

　　4. 選用商品化的DNA污染祛除劑。我們推薦的是Minerva公司的PCR CleanTM 噴霧劑、濕巾。其1分鐘即起效，方便快捷，*，可同時(shí)去除DNA和RNA。作用1分鐘后，用紙巾擦拭，即可完成對(duì)DNA污染的清除。

　　對(duì)于PCR反應(yīng)液的污染，可采取以下方法：

　　1. DNase I 法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。

　　2. 內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶（如MspI和TaqI等），可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進(jìn)行PCR。

　　3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法。

　　4. 尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：用dUTP代替dTTP，使PCR產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。

　　圖　UNG法預(yù)防污染

　　總之，靈敏度越高的PCR反應(yīng)越容易出現(xiàn)PCR污染。采用適當(dāng)?shù)拇胧┫廴荆梢员苊庵貜?fù)實(shí)驗(yàn)和浪費(fèi)試劑，也使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠而。

　　參考資料

　　唐艷榮，張海云，等。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）中主要污染源及處理方法的分析。農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)與裝備，2017（3）：99-100

　　周榮榮，李超。日照市疾病預(yù)防控制中心PCR實(shí)驗(yàn)室污染情況調(diào)查。 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床， 2017,28（5）：61-63